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试剂盒检测法

α-地中海贫血基因检测（缺失型）

α-地中海贫血（简称α-地贫）是一种由于α-珠蛋白基因突变导致肽链表达失衡而产生的单基因遗传血液病，多由α-珠蛋白基因的缺失突变所致，是我国南方各省最常见、危害最大的遗传病之一。

【检验原理】本方法主要应用跨跃断裂点PCR（Gap-PCR）的技术原理进行检测，即在待检的缺失基因片段两端设计引物进行扩增，再通过琼脂糖凝胶电泳，根据电泳片段大小判断检测样品的基因型，可同时检测3种（--^SEA、-α^3.7、-α^4.2）缺失型α-地贫。

【检验方法】

1．DNA获取：一般可用实验室常规方法或试剂盒提取人基因组DNA；

2．PCR扩增：按体系加入PCR反应液和待测样品DNA；设置阴性质控，以纯水为模板，作为空白对照；设置阳性质控，所检测的4个条带（3个缺失和1个正常条带）中，任何一个临床样品的电泳结果应至少有一个条带，否则为实验失败。

扩增程序：96℃,15min；98℃，45s,64℃,90s,72℃,3min,35循环；72℃,5min。

3．电泳检测：取5ul扩增产物加入1ul 6×溴酚蓝上校缓冲液，经1.2%琼脂糖凝胶电泳，电泳结束，将琼脂糖凝胶放入凝胶成像系统观察结果。

4．电泳条带与基因型的对应关系

β-地中海贫血基因检测（点突变）

β-地中海贫血（简称β-地贫）是一种由于β-珠蛋白基因突变导致肽链表达失衡而产生的单基因遗传血液病，多由β-珠蛋白基因点突变所致，是我国南方各省最常见、危害最大的遗传病之一。本法检测41-42M、654M、-28M、71-72M、17M、βEM、IVS-I-1M、27/28M、43M、-29M、31M、-32M、-30M、14-15M、CAPM、IntM、IVS-I-5M。

【检验原理】PCR和DNA反向点杂交。设计特异的PCR引物且其5’端用生物素进行标记，扩增获得一定长度的DNA片段，该片段包含了所要检测的各个位点。根据检测位点碱基差异，按照碱基互补配对原则，设计特异性识别某种基因的寡核苷酸探针组合，分别固定在尼龙膜的特定位置上，制成检测膜条。PCR扩增产物与探针通过分子杂交反应及显色反应，观察检测膜条上各位点信号的有无（信号为蓝色斑点），判断该探针是否与PCR产物杂交，从而确定待检样品的基因型。

【检验方法】

1．DNA获取：一般可用实验室常规方法或试剂盒提取人基因组DNA；

2．PCR扩增：按体系加入PCR反应液和待测样品DNA；设置阴性质控，以纯水为模板，作为空白对照。

扩增程序：50℃,15min；95℃,10min；94℃,1min,55℃,30s,72℃,30s,35循环；72℃,5min。

3．杂交：取15ml离心管，放入标有样品编号的膜条，加入A液(2×SSC，0.1%SDS)及PCR产物，置于沸水浴中加热10分钟后放入42℃杂交箱中杂交1.5-4小时。

4．洗膜：取出膜条，移至装有预热B液(0.5×SSC，0.1%SDS)的容器中于42℃轻摇洗涤15分钟。

5．显色：用A液：POD=2000：1配制孵育液，室温轻摇孵育30分钟后用A液室温轻摇洗两次，每次5分钟，再用C液(0.1M柠檬酸钠)室温洗膜1-2分钟。同时配显色液(新鲜配制使用，按顺序加入以下溶液：C液 19ml，TMB 1ml，30%H2O2 2ul)。将膜条浸泡于显色液中避光显色5-20分钟即可观察结果。

6．结果说明

41-42N	654N	-28N	71-72N	17N	βEN	31N	27/28M
41-42M	654M	-28M	71-72M	17M	βEM	31M	IVS-I-1M
43M	-32M	-29M	-30M	14-15M	CAPM	IntM	IVS-I-5M

注：以上位点最后一个字母“N”代表正常，“M”代表突变。

α-地中海贫血基因检测（点突变）

中国人群中常见的α-地中海贫血基因突变类型主要为--^SEA、-α^3.7、-α^4.2　3种缺失型，除此之外，还有α^CS、α^QS、α^WS>三种点突变。

【检验原理】PCR和DNA反向点杂交。设计特异的PCR引物且其5’端用生物素进行标记，扩增获得一定长度的DNA片段，该片段包含了所要检测的各个位点。根据检测位点碱基差异，按照碱基互补配对原则，设计特异性识别某种基因的寡核苷酸探针组合，分别固定在尼龙膜的特定位置上，制成检测膜条。PCR扩增产物与探针通过分子杂交反应及显色反应，观察检测膜条上各位点信号的有无（信号为蓝色斑点），判断该探针是否与PCR产物杂交，从而确定待检样品的基因型。

【检验方法】

1．DNA获取：一般可用实验室常规方法或试剂盒提取人基因组DNA；

2．PCR扩增：按体系加入PCR反应液和待测样品DNA；设置阴性质控，以纯水为模板，作为空白对照。

扩增程序：50℃,15min；95℃,10min；95℃,45min,64℃,2min,15循环；95℃,30s,49℃,30s,72℃,30s,30循环；72℃,5min。

3．杂交：取15ml离心管，放入标有样品编号的膜条，加入A液(2×SSC，0.1%SDS)及PCR产物，置于沸水浴中加热10分钟后放入48℃杂交箱中杂交1.5-4小时。

4．洗膜：取出膜条，移至装有预热B液(0.5×SSC，0.1%SDS)的容器中于48℃轻摇洗涤15分钟。

5．显色：用A液：POD=2000：1配制孵育液，室温轻摇孵育30分钟后用A液室温轻摇洗两次，每次5分钟，再用C液(0.1M柠檬酸钠)室温洗膜1-2分钟。同时配显色液(新鲜配制使用，按顺序加入以下溶液：C液 19ml，TMB 1ml，30%H2O2 2ul)。将膜条浸泡于显色液中避光显色10-30分钟即可观察结果。

6．结果说明

注：QSN、CSN、WSN分别代表α^QSα、α^CSα、α^WSα正常对照位点；QSM、CSM、WSM分别代表α^QSα、α^CSα、α^WSα突变位点。